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UMR 1332 Biologie du Fruit et Pathologie

Team : Functional Genomics of Fruit Development

Responsable : Christophe Rothan Tel. (33) 5 57 12 25 32 - E-mail : christophe.rothan@inra.fr

Présentation et objectifs de recherche :

contenu en attente

Axes de Recherches :

1 - Développement précoce du fruit

Le développement précoce du fruit de tomate est caractérisé par une longue phase d'expansion cellulaire qui peut contribuer, selon la variété, à 90 % de l'augmentation du poids du fruit. Cette expansion cellulaire a lieu dans les tissus internes du fruit (péricarpe, columelle + placenta, tissu loculaire) tandis que les cellules de l'exocarpe continuent à se diviser. La thématique de recherche porte sur l’étude des mécanismes de contrôle de la croissance du fruit lors de la phase d’expansion cellulaire chez la tomate. Les objectifs sont d’identifier des gènes exprimés durant cette phase et susceptibles de contrôler la taille de la cellule et du fruit, puis de valider leur fonction par des approches de génomique fonctionnelle. Dans ce cadre, différentes approches de transcriptomique ont été menées afin d’identifier de nouveaux gènes candidats, potentiellement impliqués dans la régulation du développement du fruit. Par ailleurs, la validation fonctionnelle de plusieurs gènes candidats potentiellement impliqués dans la différenciation des tissus du fruit et sa croissance a été initiée. 

Développement du fruit de tomate
  • Analyse intégrative du développement précoce du fruit

Ce travail a porté sur la caractérisation de deux tissus en expansion cellulaire (le mésocarpe et le tissu loculaire) par l’intégration d’approches complémentaires de cytologie, de transcriptomique et de métabolomique. L’analyse du métabolome a montré que ces deux tissus se distinguent par leur composition métabolique lors de la phase d’expansion cellulaire. L’analyse du transcriptome a montré une plus forte variation d’expression des gènes dans le tissu loculaire que dans le mésocarpe, et, pour chaque tissu, des variations d’expression plus importantes vers la fin de la phase d’expansion cellulaire (entre 20 et 35 DPA). L’intégration des données du transcriptome et du métabolome a permis de mettre en évidence des corrélations directes entre « gène de régulation »/métabolite ainsi qu’un réseau de corrélation mettant en évidence des gènes qui peuvent constituer des nœuds de régulation. Ces gènes de régulation constituent des candidats intéressants au contrôle du développement/métabolisme du fruit de tomate (Mounet et al., 2007 ; Mounet et al., 2009).

Analyse intégrative du développement précoce du fruit
  • Validation fonctionnelle de gènes candidats impliqués dans le développement précoce du fruit charnu

Nous avons initié l'étude de gènes candidats, potentiellement impliqués dans la régulation du développement des tissus du fruit, par des approches de génomique fonctionnelle : recherche de mutants dans une population EMS MicroTom par TILLING, transformation classique pour induire une sur- ou sous-expression du gène d'intérêt.Un transporteur d’efflux d’auxine (Sl-PIN-A2) est particulièrement exprimé dans le tissu loculaire. Nous avons pu montrer qu’il correspond au gène PIN de tomate le plus fortement exprimé dans la fleur et le fruit. Les plantes transgéniques P35S:Sl-PIN-A2RNAi sont caractérisées par le développement de fruits parthénocarpiques. Les résultats obtenus suggèrent que le métabolisme de l’auxine est transitoirement modifié dans les fleurs de ces lignées ce qui affecte les mécanismes de régulation impliqués dans la croissance du carpelle et conduit au déclenchement prématuré du développement du fruit.Les protéines à F-BOX font partie des complexes SCF (Skp1, Cullin, F-Box) et sont considérées comme des acteurs majeurs des processus de régulation impliquant la dégradation de protéines par le protéasome 26S. Afin d’initier une analyse fonctionnelle de ces protéines chez la tomate, nous avons retenu, dans un premier tri, 18 protéines à F-BOX qui étaient présentes dans les bases de données d’EST de fruit de tomate. Puis, une analyse d’expression par qRT-PCR, nous a permis de retenir quatre candidats qui présentaient des profils d’expression tissulaire intéressants. Des constructions RNAi/sur-expression sous le contrôle du promoteur 35S ont été réalisées. La sélection et le phénotypage de plantes T2 homozygotes est actuellement en cours.Des gènes candidats régulateurs mis en évidence par l’approche intégrée métabolome transcriptome ont également été  retenus pour une validation fonctionnelle. Afin d’étudier le rôle de ces gènes et leur implication dans le développement du fruit de tomate, des plantes transgéniques T0 (variété microtom, RNAi/surexpression de ces gènes candidats) ont été générées et sont en cours de caractérisation phénotypique et moléculaire. Des mutants EMS (dont un KO) ont également été sélectionnés par TILLING.De nouveaux vecteurs pour l’analyse fonctionnelle dans le fruit de tomate ont été développés afin de palier aux problèmes rencontrés par l’utilisation des vecteurs de transformation des plantes dans lequel le promoteur 35S du virus de la mosaïque du choux fleur est utilisé. Ce travail a été réalisé dans le cadre du projet européen EU-SOL. Pour cela quatre promoteurs de tomate PPC2, TPRP, polygalacturonase, IMA et un promoteur d’arabidopsis CRABS-CLAW ont été introduits dans des vecteurs GATEWAY pour la transformation des plantes par l’équipe de P. Hilson au VIB (Ghent). Différentes fusions transcriptionnelles ont été réalisées promoteur:GUS, promoteur:NLS:GUS-GFP et promoteur:LePDSami. Environ 300 plantes T0 ont été générées (variété microtom). L’analyse des fenêtres d’expression de ces promoteurs dans le fruit et dans les tissus végétatifs chez la tomate nous a permis de valider leur utilisation pour des analyses fonctionnelles ultérieures. (Fernandez et al, 2009).

Validation fonctionnelle de gènes candidats impliqués dans le développement précoce du fruit charnu

2 - Vitamine C

Les fruits et les légumes frais sont les principales sources de vitamine C (acide L-ascorbique) dans l'alimentation humaine, et également pour quelques mammifères qui ont perdu la capacité de synthétiser cette vitamine en raison d'une mutation du gène codant pour la dernière enzyme de la voie de biosynthèse : la L-gulono-lactone oxydase. La vitamine C possède de nombreuses propriétés, tout particulièrement comme anti-oxydant hydro-soluble majeur de la cellule vivante. Chez les plantes, la vitamine C est un composé anti-oxydant vital car elle protège les cellules végétales des effets liés au stress oxydatif. De plus, de nombreux travaux suggèrent qu'elle participerait également dans de nombreux processus tels que le développement des plantes, la signalisation hormonale, l'activation du cycle cellulaire et probablement dans les processus impliqués dans la perte d'intégrité des parois lors de l'expansion cellulaire et la maturation du fruit.

Chez les plantes, une voie majeure de biosynthèse de la vitamine C a été décrite récemment par les travaux de Smirnoff en 2000; elle est distincte de la voie animale et implique des formes activées d'hexoses tels que le GDP-D-mannose, GDP-L-galactose et L-galactose, avant que finalement la L-galactono-lactone soit convertie en acide L-ascorbique (Figure 1). L'établissement de cette voie spécifique des plantes a été possible grâce à l’étude et la caractérisation de mutants d' Arabidopsis qui présentent de faibles teneurs en vitamine C. En plus de la voie dite de Wheeler&Smirnoff, plusieurs voies alternes de biosynthèse de la vitamine C ont été proposées. La première aurait comme intermédiaires le GDP-gulose et le L-gulose par analogie à la voie Smirnoff qui utilise le galactose (Wolucka et al., 2003 ) ; la seconde voie possible utiliserait comme précurseur le myo -inositol et pourrait présager de l'existence d'une voie de type animal chez les plantes (Lorence et al ., 2004) ; enfin la troisième voie qui a uniquement été décrite chez la fraise, impliquerait la conversion de l'acide D-galacturonique, dérivé de la dégradation des composés pariétaux, pour donner l'acide L-ascorbique en passant par son précurseur, la L-galctono-1,4-lactone (Agius et al., 2003) .

Vitamine C chez la tomate

Par ses propriétés anti-oxydantes, la vitamine C existe sous plusieurs formes, l'acide ascorbique réduit qui est la forme active pour la cellule et la forme oxydée ou acide dihydroascorbique (DHA) qui provient de son action anti-oxydante. Chez les plantes, en plus de la voie de biosynthèse, la cellule a mis en place des mécanismes enzymatiques qui permettent de recycler la vitamine C. Ainsi, la teneur en ascorbate d'une plante est ajustée et contrôlée à la fois par le taux de biosynthèse, le taux de recyclage mais également par la voie de dégradation de l'ascorbate ainsi que son transport dans la cellule et au sein des différents organes de la plante. A ce jour, la régulation de métabolisme de l'ascorbate (synthèse, recyclage et dégradation) ainsi que les mécanismes impliqués dans le transport de l'ascorbate restent encore mal connus.

Parmi les fruits, la tomate a une place prépondérante car elle représente non seulement une culture majeure (premier fruit produit dans le monde) mais également le modèle pour l'étude du développement du fruit charnu. Malgré sa faible teneur en vitamine C (20 à 50 mg AsA/100 g de matière fraîche), la tomate représente une source non négligeable en vitamine C car elle est le fruit le plus consommé par l'homme. Au niveau génétique, la tomate présente une grande variabilité en termes de teneur en ascorbate. Enfin, grâce aux efforts conjoints de la communauté internationale “Solanacae”, depuis le début 2010 le génome de la tomate est disponible (Fig. 2).

Voies de biosynthèse de l'acide ascorbique (vitamine C) chez les plantes

Afin de comprendre le rôle physiologique de l'acide L-ascorbique (vit C) dans le développement des plantes et celui du fruit notamment en relation avec l’établissement de ses critères de qualité (croissance, taille, maturation et texture du fruit), nous avons développé depuis 2003 au laboratoire une approche de transgénèse par RNA interférence (RNAi) ou/et de sur-expression de gènes qui cible certains gènes clés de la voie majeure de biosynthèse de la vitamine C. Cette recherche nous a permis d'obtenir plusieurs lignées transgéniques pour 3 enzymes de la voie : la GDP-mannose pyrophosphorylase (GMP), la GDP-mannose épimérase (GME) et la L-galactono-lactone-1,4-déshydrogénase (GalLDH). Ces lignées transgéniques de tomate servent de support à l'étude physiologique du rôle et de la régulation de la vitamine C chez la tomate, à l'aide notamment d'outils de génomique comme l’analyse du transcriptome, du métabolome, et plus récemment des approches de Tilling (Targeting Induced Local Lesions in genomes).

  • Caractérisation fonctionnelle de la L-Galactono-1,4-Lactone Déshydrogénase (GalLDH)

Les lignées transgéniques P35S:SlgalldhRNAi générées présentent une réduction de l’expression du gène, de la protéine ainsi que son activité, et montrent une altération du développement végétatif sans que les teneurs en ascorbate soit changées par rapport aux plantes sauvages (Alhagdow et al., 2007). Toutefois, pour les cas les plus sévères, la teneur en ascorbate des feuilles est réduite de plus de 80% et les phénotypes observés se traduisent par un nanisme important des plantes et une absence totale de fruit. Ceci suggère l’existence d’un seuil de teneur en ascorbate en dessous duquel le développement normal des plantes est pratiquement impossible. Pour les autres lignées P35S:SlgalldhRNAi, la réduction de plus de 80% de l’activité de la SlGalLDH entraine une diminution de la taille des feuilles et des fruits, conséquence directe de la réduction de l’expansion cellulaire (Fig. 3).

Phénotypes observés chez les plantes P35S:SlgalldhRNAi

 Ceci s’accompagne également d’une altération de l’état rédox des cellules ainsi que de changements significatifs des fonctions mitochondriales (Coll. B Beauvoit, Univ. Bordeaux 2). Par la combinaison d’une approche transcriptomique et métabolomique (Coll. A. Fernie, MPI Golm) réalisée chez les feuilles et les fruits de ces plantes, nous avons pu montrer les modifications majeures existantes dans plusieurs voies métaboliques primaires, notamment le cycle de Krebs, ou du métabolisme secondaire reliées à la réponse au stress. Tous ces résultats ont confirmé la complexité de la régulation de biosynthèse de l’ascorbate et des liens qui peuvent exister entre les différents métabolismes de la plante. De plus, ce travail souligne l’importance du rôle que la SlGalLDH pourrait avoir dans la croissance cellulaire en particulier au sein de la respiration et du fonctionnement de la mitochondrie.

Collaborations : A. Fernie (Max Planck Institute-Golm, Allemagne) et B. Beauvoit (UBF Université Bordeaux 2)

  • Caractérisation fonctionnelle de la GDP-D-Mannose-3,5-Épimérase (GME)

La GDP-D-mannose 3,5-épimérase, qui convertit le GDP-D-mannose en GDP-L-galactose, est généralement considérée comme une enzyme centrale pour la voie majeure de biosynthèse de l’acide L-ascorbique chez les végétaux supérieurs. L’utilisation de lignées transgéniques P35S:SlgmeRNAi sous exprimant les deux gènes GME1 et GME2 de tomate nous a permis de confirmer le rôle clé de cette enzyme dans la régulation de la biosynthèse de l’ascorbate chez les plantes. Chez les plantes P35S:SlgmeRNAi, la teneur en ascorbate peut être réduite jusqu’à 70%. Par ailleurs, ces lignées présentent des défauts de croissance qui résultent à la fois d’une altération des processus de division et d’expansion cellulaire. Un phénotype original a également été observé chez les plantes P35S:SlgmeRNAi, une fragilité accrue des tiges et la perte de fermeté du fruit au touché (Fig.4).

Phénotypes observés chez les plantes P35S:SlgmeRNAi

Ce dernier phénotype est très intéressant puisqu’il touche au critère de qualité ʺtexture et fermetéʺ de la tomate, et des analyses de fermeté réalisées en collaboration avec D. Page (INRA-Avignon) ont permis de confirmer cette caractéristique. Les analyses immunocytochimique et de composition de la paroi des feuilles et des fruits en développement des lignées P35S:SlgmeRNAi ont révélé des modifications des structures et teneurs en différents monosaccharides présents dans ce compartiment (Fig.5), et en particulier pour ceux liés directement à l’activité GME tel que les hémicelluloses mannanes (Coll. M. Lahaye, Nantes). Ces lignées P35S:SlgmeRNAi ont également été analysées au niveau du transcriptome (J. Petit UBF INRA-Bordeaux), protéome (Coll. M Faurobert, INRA-Avignon), métabolome (Coll. A. Fernie, MPI-Golm) ainsi qu’au niveau du profil de glycosylation des protéines (Coll. P. Lerouge, Université Rouen). Par ailleurs, l’analyse de composition et structure du rhamnogalacturonane II (RG-II), composé pectique complexe et essentiel de la paroi (Fig.5), semble démontré que chez les plantes P35S :SlgmeRNAi le RGII renferme moins de L-galactose par rapport aux plantes contrôle, ce qui induirait un défaut de dimérisation du RGII (Coll. P. Lerouge, Rouen).

Rôle de la GME dans la synthèse pariétale

L’ensemble des résultats met en évidence la relation étroite entre la biosynthèse de l’ascorbate et la biosynthèse des polysaccharides pariétaux non-cellulosiques chez les plantes, ce qui permet d’aborder de façon originale la qualité du fruit de tomate sous l’angle aspects nutritionnel (Vit C) et organoleptique (texture-fermeté) chez les plantes sous exprimant la GME. L’ensemble des données issues de ce travail a fait l’objet d’une publication parue dans la revue Plant Journal (Gilbert et al., 2009) et d’une publication prochainement soumise par l’équipe de P. Lerouge dans la même revue.

Collaborations : A. Fernie, Max Planck Institute-Golm, Allemagne, M. Lahaye UBIA INRA-Nantes, M Faurobert, UGAFL INRA-Avignon ; D. Page, SQPOV INRA-Avignon, R. Stevens, UGAFL INRA-Avignon, M. Causse, UGAFL INRA-Avignon et P. Lerouge, Université de Rouen.

  • Caractérisation fonctionnelle des gènes GME1 et GME2 codant pour la GDP-D-mannose-3’,5’-épimérase chez la tomate : Rôle dans l’embryogenèse et le développement de la fleur ?

Suite à l’analyse des plantes P35S :SlgmeRNAi chez lesquelles les deux copies étaient sous-exprimées, il semblait essentiel de mieux comprendre la fonction de chacun des gènes GME chez la tomate. Ainsi les gènes GME1 et GME2 pouvaient avoir un rôle redondant à la fois pour la synthèse de la vitamine C et celle des polysaccharides pariétaux ou posséder un rôle spécifique dans l’une de ces deux voies. Nous avons montré par analyse d’expression transitoire que ces deux protéines sont présentent dans le cytosol de la cellule (Coll P. Moreau, CNRS-Bordeaux). Par la suite ont été générées des lignées RNAi sous-exprimant spécifiquement GME1 ou GME2 notées P35S :Slgme1RNAi et P35S :Slgme2RNAi. A l’inverse des plantes P35S :SlgmeRNAi, la réduction d’expression de GME1 et GME2 n’entraine pas de diminution de teneur en ascorbate. On peut conclure qu’il existe une redondance fonctionnelle des gènes GME1 et GME2 en ce qui concerne la biosynthèse de l’acide ascorbique. L’analyse révèle que seules les lignées P35S :Slgme1RNAi présentent des phénotypes originaux notamment des défauts lors de la fécondation et de l’embryogenèse, associés à une réduction importante du nombre et la taille des fruits ainsi que de nombreux fruits parthénocarpiques (Fig.6).

Taille et teneur en ascorbate des fruits mûrs de plante sauvage et transformant P35S :Slgme1/2RNAi

Comme dans le cas des plantes P35S :SlgmeRNAi, ces phénotypes sont probablement associés au rôle de la GME dans la biogénèse des parois. Ils pourraient être liés aux modifications de la composition des parois en mannanes ou rhamnogalacturonane II, car plusieurs travaux montrent que ces polymères ont un rôle dans la formation des tissus reproducteurs, lors de la fécondation et/ou dans le développement de l’embryon. Ces résultats suggèrent une répartition spatio-temporelle différente des activités GME et conduisent à de nouvelles hypothèses en ce qui concerne le rôle du GDP-D-mannose, substrat de la GME, dans la paroi des organes reproducteurs. Cette étude est également menée en collaboration avec M. Hernould (UBF, Université Bordeaux 2) pour les aspects développement floral et embryogénèse, ainsi que pour les aspects paroi avec M. Lahaye (INRA-Nantes) et P Lerouge (Université Rouen).

Collaborations : P. Moreau, Lab. Biogenèse Membranaire, CNRS-Bordeaux ; M. Lahaye, UBIA INRA-Nantes ; P. Lerouge, Université Rouen ; M. Hernould, UBF Université Bordeaux 2.

  • Approche de biologie intégrative pour décrypter les interactions complexes entre le métabolisme de l’ascorbate, la croissance et la composition de la tomate

Cette approche avait pour but de mieux comprendre les relations complexes entre la biosynthèse et le recyclage de l’ascorbate d’une part, et les autres voies métaboliques actives dans le fruit d’autre part (Garcia et al., 2009). Pour cela, nous avons combiné les données du transcriptome, métabolome (A Fernie, Golm) et protéome ainsi que les données phénotypiques du fruit aux stades vert (20 jours après anthèse) et orange des plantes sauvages et des lignées transgéniques P35S:SlgalldhRNAi et P35S:SlgmeRNAi . A cela nous avons ajouté le même jeu de données issues de l’analyse des plantes P35S:SlaoRNAi et P35S:SlmdharRNAi (AO pour l’ascorbate oxydase et MDHAR pour la monodéhydroascorbate réductase), enzymes du recyclage de l’ascorbate (R. Stevens, INRA-Avignon). La mise en place de différents outils informatiques et statistiques a permis d’intégrer l’ensemble de ces données (V. Garcia, UBF INRA-Bordeaux ; A. de Daruvar, Univ. Bordeaux ; JL. Giraudel, Univ. Périgueux ; B. Usadel, MPI Golm). Nous avons pu ainsi mettre en évidence ou confirmer des relations majeures entre la biosynthèse de l’ascorbate et des composés de la paroi (hémicelluloses, pectines) mais aussi avec d’autres voies métaboliques. Cette approche de biologie intégrative est un outil original pour l’analyse des interactions entre différentes voies métaboliques (autres que celles des polysaccharides pariétaux) et celles de synthèse et de recyclage de l’ascorbate, ainsi que pour la prédiction de gènes candidats impliqués dans la régulation de la voie de biosynthèse de l’ascorbate. Elle permettra également d’identifier la co-régulation de voies métaboliques. Bien qu’encore très préliminaire, ce travail représente une mine de données pour le recherche de gènes candidats régulateurs de la teneur en ascorbate chez la tomate et les plantes en général. Parmi ces gènes, certains sont en cours de validation, notamment au travers d’approche de Tilling (Targeting Induced Local Lesions in genomes) grâce à l’utilisation de deux collection de mutants EMS chez la variété MicroTom (Coll. H. Ezura, Tsukuba University, Japan).

Collaborations : R. Stevens, UGAFL INRA-Avignon ; D Rolin, UBF INRA-Université Bordeaux 2 ; H Gautier, UPSH INRA-Avignon ; M Lahaye, UBIA INRA-Nantes ; D Page, SQPOV INRA-Avignon ; M. Faurobert, UGAFL INRA-Avignon ; J-L Giraudel, Université de Bordeaux 1, Périgueux ; A de Daruvar, CBIB Université Bordeaux 2, B Usadel et A Fernie, Max-Planck-Institute Golm, Germany, H. Ezura, Université de Tsukuba, Japon.