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UMR 1332 - Biologie du Fruit et Pathologie

UMR 1332 Biologie du Fruit et Pathologie

Equipe Organogenèse du Fruit et Endoréduplication (OrFE)

Responsable : Christian Chevalier, DR2 INRA, Directeur Adjoint de l’UMR1332 BFP ; 0557122693, christian.chevalier@inra.fr

Présentation et objectifs de recherches :

L’équipe "Organogenèse du Fruit et Endoréduplication" s’intéresse à la biologie du développement des fruits charnus,avec pour objectif d'acquérir une meilleure connaissance des mécanismes mis en jeu lors de la mise en place des organes reproducteurs à travers l’induction florale et le développement précoce du fruit, afin de contribuer à l'amélioration des critères de qualité du fruit, en utilisant la tomate et la fraise comme fruit modèle et fruit d’application respectivement. L’équipe OrFE s'intéresse à la caractérisation des événements génétiques, physiologiques, cytologiques et moléculaires impliqués dans le processus de la fructification et du développement précoce du fruit, et contribuant à l'élaboration de sa taille finale et de sa qualité.
   L’étude des mécanismes associés au contrôle de la taille des cellules et de la taille finale du fruit représente un axe thématique historique de l’équipe, assurant sa renommée et son positionnement international. Les études sur le modèle fraisier concernant le déterminisme de l’induction florale et du développement des fruits et des déterminants génétiques contribuant à la qualité du fruit, récemment intégrées dans l’équipe, sont fortement reconnues tant au plan international que national, et bénéficie d’une intégration solide dans la filière professionnelle fraisicole.
   Les démarches utilisées dans l’équipe pour étudier ces différentes problématiques font appel à une combinaison d’approches complémentaires de génétique quantitative et d’association (fraisier), de génomique fonctionnelle (fraisier et tomate), et de cytologie (tomate).

Le fruit est un organe spécialisé qui fournit aux graines  un environnement favorable à leur maturation et à leur dispersion. Chez la tomate (Solanum lycopersicum Mill.), le programme de développement précoce du fruit se déroule schématiquement en trois phases successives. La phase I conduit à la maturation de l’ovaire et à la “décision” de former un fruit (nouaison) ou d’avorter. La phase II se traduit principalement par une activité mitotique intense au niveau de tous les tissus de l’ovaire. La phase III est essentiellement caractérisée par une expansion cellulaire et par une augmentation considérable du volume du fruit, aboutissant à un fruit apte à s'engager dans les processus de la maturation.
   L’élaboration de caractères primordiaux pour la qualité du fruit (comme sa taille, sa masse et sa composition en métabolites primaires et secondaires) se détermine précocement au cours du développement. La taille finale du fruit dépend (i) de la formation des patrons de développement qui peut se déterminer très tôt lors de l’initiation florale, (ii) du nombre de cellules du fruit, fixé à l’issue des divisions cellulaires qui ont lieu avant et après la fécondation et (iii) de la taille des cellules, déterminée principalement lors de la phase d’expansion cellulaire du développement du fruit durant laquelle s'accumulent acides citrique et malique, composants essentiels du goût avec les sucres. Chez la tomate l’augmentation de la taille des cellules du fruit peut atteindre des niveaux spectaculaires: des centaines voire des milliers de fois la taille initiale d’une cellule. Cette variation de la taille des cellules s’accompagne d’une augmentation du niveau de ploïdie nucléaire. Cette polyploïdie résulte de la capacité des cellules à modifier leur cycle cellulaire classique en un cycle altéré où la synthèse d’ADN se déroule de façon indépendante, en absence de  mitose. Ce cycle cellulaire partiel s’appelle le cycle d’endoréduplication. Division cellulaire, expansion cellulaire et endoréduplication sont sous le contrôle d’interactions complexes entre des facteurs externes à la plante (allocation du carbone photosynthétique, influences environnementales) et signaux internes (régulations développementale et hormonale). Aussi les gènes codant pour des régulateurs de la division cellulaire tels que des intégrateurs des signaux hormonaux, des facteurs de transcription ou des protéines du cycle cellulaire sont les candidats dont l'étude fonctionnelle a pour objet de déterminer les bases moléculaires contrôlant la taille du fruit.

Dans un contexte socio-économique d’importance pour la Région Aquitaine, et avec un objectif appliqué de maîtrise de la production (rendement et qualité du fruit), l’équipe OrFE développe une thématique de recherche sur les déterminismes génétiques de l’induction florale chez le fraisier. Le fraisier diploïde (Fragaria vesca) s'impose comme modèle d'analyse fonctionnelle chez les rosacées. Le genre offre en outre un modèle pour l'application de connaissances génériques obtenues sur fraisier diploïde, au fraisier cultivé octoploïde (Fragaria × ananassa). L’espèce Fragaria vesca peut être transformée (plus facilement que les autres espèces de rosacées). De nombreuses ressources sont actuellement disponibles pour lesquelles la composante fraise de l'équipe OrFE a largement contribué et qu'elle continue à enrichir : séquence complète du génome du fraisier diploïde ; collections de fraisiers « sauvages » (diploïdes à octoploïdes) et des génotypes de fraisiers des bois (F. vesca, 2x) ;  développement d’une collection de mutants EMS pour TILLING ; transformation génétique en cours d’acquisition pour des études de génomique fonctionnelle.

Axes de recherches :

I - Caractérisation fonctionnelle de gènes associés à la régulation de l’organogenèse du fruit

Dans le cadre de cette thématique, nous nous intéressons principalement à deux gènes candidats : (1) le gène INHIBITOR OF MERISTEM ACTIVITY (IMA) régulateur négatif de l’activité méristèmatique, impliqué dans les programmes génétiques du développement des ovules et du fruit chez la tomate, à l’interface des voies de signalisation hormonales ; (2) le gène FW2.2 associé au QTL majeur qui gouverne la taille du fruit chez la tomate, pour lequel la fonction et l’impact sur la croissance du fruit restent énigmatiques.

INHIBITOR OF MERISTEM ACTIVITY (IMA):

- Analyse moléculaire du mécanisme d’interaction d’IMA avec ses cibles protéiques: mise en évidence de la sous-unité CSN5A du COP9 signalosome comme seul interactant détecté par double-hybride ; analyse de la fonction d’IMA sur l’état de neddylation de la sous-unité CULLINE1.

- Analyse du rôle d’IMA dans la signalisation hormonale en relation avec l’activité méristématique, l’intégration des signaux hormonaux et la dégradation protéolytique d’effecteurs.

- Analyse du contrôle génétique de la terminaison du méristème floral au travers des relations d’IMA et des gènes identitaires AGAMOUS, WUSCHEL et KNUCKLES.

IMA 2014
FW2.2:

- Confirmation de la localisation subcellulaire de la protéine FW2.2 (fusionnée à la EYFP) par expression transitoire dans des plantules de tabac et d’Arabidopsis ;

- Génération de surexpresseurs de FW2.2 chez Arabidopsis montant une réduction de taille de l’ensemble des organes et notamment des siliques ; phénotype d’altération de la taille cellulaire dans le parenchyme foliaire, avec malformation des stomates (problèmes de division des cellules méristémoïdes).

- Création d’une banque double hybride en split-ubiquitin pour la recherche spécifique d’interactants avec  une protéine membranaire ; criblage de la banque en cours.

- Recherche de la mise en évidence d’une fonction putative de transporteur d’ions pour FW2.2 : croissance des surexpresseurs sur milieux enrichis en ions ; analyses électrophysiologiques en ovocytes de Xénope.

FW2.2

II - Etude de la contribution de la division cellulaire et de l'endoréduplication dans la croissance du fruit

Le processus d’endoréduplication (synthèse d’ADN en l’absence de mitose) se rencontre chez tous les angiospermes et dans de multiples types cellulaires. Néanmoins son rôle physiologique reste largement méconnu. Le rôle de l'endoréduplication en tant qu’inducteur de l'expansion cellulaire est couramment proposé puisqu’une corrélation positive entre taille des cellules et des organes et endoréduplication a été fréquemment rapportée dans de nombreuses espèces de plantes. L’équipe  s’intéresse à élucider le rôle de l’endoréduplication chez les fruits charnus et la tomate en particulier. Nous étudions plus particulièrement son rôle en tant qu’inducteur de l'expansion cellulaire, mais également sa relation potentielle avec le contrôle de l’expression génique.

Endoreduplication

Ces travaux ont bénéficié du financement d’un projet ANR Génomique Végétale ENDOREPIGEN (2010-2012), dont j’étais le coordinateur, avec une forte implication de S. Brown (ISV, plateforme Imagif).

Les travaux de l’équipe OrFE ont contribué (1) à démontrer le rôle de l’endoréduplication dans la croissance des cellules et des organes selon la théorie du rapport karyoplasmique : l’augmentation du niveau de ploïdie influence la taille finale des cellules qui tendent à ajuster leur volume cytoplasmique au contenu en ADN nucléaire ; (2) à démontrer pour la première fois chez les plantes, la contribution de l’endoréduplication dans le contrôle des activités transcriptionnelles.

Endo cell 2014

III - Caractérisation fonctionnelle de gènes associés à la régulation du cycle cellulaire et de l’endocycle

L’équipe étudie le rôle des régulateurs du cycle cellulaire dans le contrôle de l’endoréduplication, associés à l’inhibition des activités des complexes CDK/Cycline résultant (i) d’une modification de l’état de phosphorylation de la CDK (rôle de WEE1); (ii) de la disponibilité en sous-unités cyclines contrôlée par dégradation protéolytique (rôle de CSS52); (iii) et de la présence d’inhibiteurs spécifiques de CDK (rôle des KRPs).

Kinase WEE1:

- Mise en évidence de l'implication de la kinase WEE1 dans le déterminisme du processus d'endoréduplication : analyse fonctionnelle de mutants de perte de fonction (plantes transgéniques hébergeant la construction Pro35S:WEE1as) présentant une diminution de la taille des fruits, de la taille des cellules et des niveaux d’endoréduplication ; raccourcissement de la phase G2 dans une culture synchronisée de cellules de tabac BY2 par surexpression de WEE1.

Inhibiteurs de CDKs KRPs:

- Analyse fonctionnelle des domaines structuraux de la protéine SlKRP1 par étude des interactions protéines-protéines (double hybride levure et BiFC), co-localisation de protéines partenaires dans les cellules végétales ; mise en évidence d’un domaine d’interaction avec la sous-unité CSN5A du signalosome et relation avec la machinerie de dégradation protéolytique et d’un nouveau domaine d’interaction avec les cyclines D3.

- Analyse fonctionnelle de mutants de gain de fonction (plantes transgéniques hébergeant la construction ProPEPC2:KRP1OE, surexpression mésocarpe-spécifique de KRP1 de tomate) présentant une diminution des niveaux d’endoréduplication, sans affecter la taille des cellules et la taille des fruits ; découplage de la taille cellulaire et de l’endoréduplication induit dans le fruit.

Activateurs de l’APC (CCS52A et CCS52B):

- Clonage des gènes CCS52A et CCS52B de tomate : expression spécifique de CCS52B dans la mitose, expression de CCS52A lors de l’endoréduplication;

- Analyse fonctionnelle des plantes transgéniques perte-de-fonction : diminution des niveaux de ploïdie dans les plantes Pro35S:CCS52AAS et taille du fruit plus petite; phénotype fruit plus grand pour les plantes Pro35S:CCS52BAS par surexpression endogène de CSS52A induisant une augmentation de la ploïdie.

- Analyse fonctionnelle des plantes transgéniques gain-de-fonction : augmentation des niveaux d’endoréduplication dans les plantes surexprimant CCS52A (Pro35S:CCS52AOE) ; taille du fruit légèrement plus petite que le WT mais accélération de la croissance du fruit en fin de développement par augmentation de la taille cellulaire et des niveaux d’endoréduplication.

- Analyse fonctionnelle des plantes transgéniques gain-de-fonction : augmentation des niveaux d’endoréduplication dans les plantes surexprimant CCS52A (ProPEPC2:CCS52AOE) ; taille du fruit plus importante que le WT avec augmentation des niveaux d’endoréduplication ; pas d’effet phénotypique de la surexpression de CCS52B (ProPEPC2:CCS52BOE) en dehors de sa fenêtre naturelle d’expression (phase de divisions cellulaires).

Cycle Endocycle

IV - Analyse du déterminisme génétique et moléculaire de l’induction florale et de la qualité du fruit chez le fraisier

L'objectif de cette thématique est d’acquérir des connaissances fondamentales sur les facteurs génétiques, moléculaires et physiologiques qui gouvernent la floraison et plus précisément l'induction florale chez le fraisier.
La floraison est un événement majeur qui conditionne bon nombre de caractéristiques agronomiques, en particulier le rendement. En effet, chez les plantes, le rendement en fruit/graine est conditionné par le potentiel de floraison mis en place au moment de l'initiation florale. Une approche originale pour mieux comprendre l’initiation florale est l'étude de la remontée florale qui est la capacité d’un plant à initier puis fleurir tout au long de la période végétative et non plus seulement en jours courts pour le fraisier (plants remontants vs plants non remontants).
Nos études font appel à des approches (i) de génomique comparative entre fraisier diploïde (fraisier des bois) et octoploïde (fraisier cultivé), (ii) de recherche de QTL lié à la remontée florale et (iii) de gènes candidats.

4.1 Analyse du déterminisme génétique et moléculaire de l’induction florale:

L'objectif est d’acquérir des connaissances fondamentales sur les facteurs génétiques, moléculaires et physiologiques qui gouvernent la floraison et plus précisément l'induction florale. Ces connaissances permettront la mise en place d'outils pour les professionnels pour aller vers une production de fraises sur une période plus longue tout en évitant les pics de production.
Les recherches conduites visent à analyser le rôle des gènes impliqués dans la floraison et la remontée florale (critère majeur pour la productivité des plants) chez le fraisier diploïde et le fraisier octoploïde : le gène répresseur KSN (orthologue de Terminal Flower1-TFL1), et les gènes activateurs FT1, FT2 et FT3 orthologues du gène Flowering Locus T (FT).
Un second axe de recherche vise à analyser les déterminants génétiques impliqués dans la compétition entre organes reproducteurs et multiplication végétative par production de stolons chez le fraisier.

4.2 Analyse des stades précoces du développement et des déterminants génétiques de la qualité du fruit:

Grâce à un phénotypage métabolique détaillé et à des analyses d’expression de gènes à grande échelle des collections génétiques et d’une population en ségrégation disponible au laboratoire, différentes cibles ont été identifiées pour plusieurs des caractères d’intérêt. Ces cibles majeures sont : (1) les antioxydants issus du métabolisme secondaire, parmi lesquels les anthocyanes jouent un rôle dans la couleur du fruit, ainsi que la vitamine C; (2) les aspects sensoriels : gustatifs (sucres, acides organiques), visuels (brillance), et fermeté.
L’analyse des déterminants génétiques de la qualité du fruit font appel aux approches suivantes : (1) l'identification de QTL liés aux caractères étudiés ; (2) l'identification de gènes candidat à travers des analyses de transcriptome ; (3) la validation fonctionnelle (transitoire et stable) des candidats identifiés chez le fraisier (technologie de transformation acquise et mise en place au sein de l’équipe OrFE).

Fraisier 2014