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UMR 1332 - Biologie du Fruit et Pathologie

UMR 1332 Biologie du Fruit et Pathologie

Equipe Mollicutes

Responsable: Pr. Alain Blanchard - Tél. 05 57 12 23 93 - E-Mail: alain.blanchard@inra.fr

Présentation et objectifs de recherches :

Les recherches concernent à la fois des bactéries pathogènes de plantes (phytoplasmes, spiroplasmes et protéobactéries), la plupart non cultivées, et des bactéries pathogènes d'animaux (mycoplasmes). Phytoplasmes, spiroplasmes et mycoplasmes appartiennent à la classe Mollicutes, un groupe de bactéries sans paroi et à petits génomes qui comprend des agents pathogènes de l'homme des animaux et des plantes. Par l'intégration de ses travaux sur les divers mollicutes et ses collaborations, l'équipe constitue un pôle expert sur ce groupe d’organisme, sur le plan national et international.

L'objectif général de l'équipe est de produire des connaissances fondamentales sur l'évolution des génomes de mollicutes et sur les mécanismes moléculaires qui gouvernent les interactions de ces bactéries "minimales" avec leurs hôtes eucaryotes. Une part de nos activités, plus finalisée, est également consacrée à l'étiologie et l'épidémiologie des bactérioses du phloème émergentes.

Les études fonctionnelles se concentrent sur un nombre limité d'organismes. Spiroplasma citri, disponible en culture et génétiquement manipulable, et les phytoplasmes du Stolbur/Bois Noir et Flavescence Dorée de la vigne. Pour les mycoplasmes animaux, les travaux actuels sont centrés sur les mycoplasmes de ruminants et plus particulièrement Mycoplasma mycoides subsp. mycoides, responsable de la péripneumonie contagieuse bovine.

Axes de recherches :

1 - Etiologie, diagnostic et épidémiologie des bactérioses phloémiennes

Contacts :

- Xavier Foissac (xavier.foissac@inra.fr)

- Sylvie Malembic (sylvie.malembic@inra.fr)

Les bactérioses phloémiennes sont des maladies incurables et leur contrôle repose sur la prévention. Nous développons des outils de diagnostic moléculaire ciblant l’ADN de ces bactéries qui permettent la détection puis l’élimination des plantes infectées. Le séquençage des génomes de ces bactéries a permis le développement d’outils de génotypage bactérien qui servent à retracer l’origine des contaminations et leurs voies de propagation. Nous décrivons les espèces bactériennes nouvelles, démontrons leur rôle étiologique et identifions leurs plantes réservoirs et leurs insectes vecteurs. Enfin, nous développons l’usage des marqueurs génétiques prédicteurs des propriétés épidémiques des phytoplasmes de façon à raisonner la lutte insecticide. Ces travaux qui portent sur la flavescence dorée et le bois noir de la vigne, mais aussi sur le dépérissement de la lavande, la chlorose marginale du fraisier et le Huanglongbing des agrumes, sont conduits en collaboration avec des laboratoires internationaux, les services de protection des végétaux et les instituts techniques. L’équipe héberge une collection unique de phytoplasmes propagés sur pervenche de Madagascar en serre de confinement qui alimente les recherches internationales et approvisionne les laboratoires de diagnostic en ADNs contrôles.

Etude de la diversité génétique des phytoplasmes du groupe V et mise en évidence d'échanges entre le compartiment sauvage et le vignoble

Etude de la diversité génétique des phytoplasmes du groupe V et mise en évidence d'échanges entre le compartiment sauvage et le vignoble

2 - Interactions des mollicutes phytopathogènes avec leurs plantes hôtes et leurs insectes vecteurs

Contacts :

- Interactions avec la plante : Sandrine Eveillard (sandrine.eveillard@inra.fr)

- Interactions avec l’insecte : Nathalie Arricau-Bouvery (natahalie.bouvery@inra.fr)

Dans le but de mieux pouvoir lutter contre les maladies à phytoplasmes (exemples : Flavescence Dorée (FD), Bois noir (BN), dépérissement de la lavande), nous étudions les interactions entre les phytoplasmes et leurs hôtes, plantes et insectes vecteurs.

Nos recherches visent à caractériser les différences de sensibilité à la Flavescence dorée au sein du genre Vitis, en termes de multiplication et de diffusion des phytoplasmes dans la plante. Pour ceci, nous inoculons le phytoplasme de la FD à différents cépages et espèces de vigne par l’intermédiaire de son insecte vecteur naturel Scaphoideus titanus. Les perturbations de l’expression des gènes et du métabolisme sont alors étudiées afin de comprendre les mécanismes impliqués dans ces différences de sensibilité. Ceci conduira à l’identification de sources de résistance chez la vigne pouvant être utilisées dans le cadre de l’amélioration variétale. A partir de la séquence du génome du phytoplasme de la FD, nous recherchons et caractérisons des effecteurs, protéines sécrétées par le phytoplasme ayant un rôle dans la pathogénie. Toutes les manipulations sont effectuées en serre de haut confinement en conditions de sécurité maximale.          

Les différentes étapes de la transmission du phytoplasme à une plante saine par l’insecte vecteur comprennent le passage à travers la barrière intestinale, la multiplication dans les tissus de l’insecte et l’invasion des glandes salivaires. La compréhension de ces mécanismes nécessite la connaissance des deux partenaires. Pour le phytoplasme de la FD, nous identifions les facteurs bactériens et les récepteurs impliqués dans l’invasion des cellules d’insecte. Dans le cas du vecteur du phytoplasme du stolbur / BN (Hyalesthes obsoletus), nous étudions les populations d’insectes vecteurs et les bactéries symbiotiques associées, en relation avec la transmission.

Mollicutes - Axe 2

1ère image à gauche, plants de vigne en serre de Haut Confinement.
2ème image, vue en microscopie à fluorescence d’une glande salivaire d’Euscelidius variegatus infectée par le phytoplasme de la FD.
3ème image, vecteur du phytoplasme de la Flavescence Dorée, Scaphoideus titanus (stade larvaire L5).
4ème image, vue en microcopie confocale de cellule d'épiderme de Nicotiana benthamiana exprimant un effecteur du phytoplasme de la FD fusionné à la YFP.

3 - Biologie de synthèse des Mollicutes

Contacts :

- Carole Lartigue (carole.lartigue-prat@inra.fr)

- Pascal Sirand-Pugnet (pascal.sirand-pugnet@inra.fr)

De nouvelles approches de biologie de synthèse permettent de cloner un génome bactérien dans la levure, de modifier celui-ci et de le re-transplanter dans une bactérie receveuse. Ces approches sont particulièrement prometteuses pour les mollicutes, peu d’outils génétiques étant jusqu’alors disponibles pour étudier ces bactéries. Jusqu’à présent, la transplantation de génome n’a été obtenue qu’avec un petit nombre de mycoplasmes. En combinant génomique comparée et biologie de synthèse, nous cherchons à étendre les techniques d’ingénierie et de transplantation de génome à de nouvelles espèces bactériennes et à les mettre en œuvre à travers des projets appliqués comme la construction de nouveaux vaccins contre des mycoplasmes infectant les animaux et l’étude de phytoplasmes, bactéries phytopathogènes non-cultivées.

Mollicutes - Axe 3

“plateforme d’ingénierie de génomes” pour les Mollicutes, utilisant des outils de biologie de synthèse
Les mycoplasmes sont, tout d’abord, transformés avec un plasmide navette “levure/mycoplasme” intégratif (rectangle rouge). Ce plasmide contient des éléments nécessaires à sa réplication et sa propagation dans la levure (le centromère (Cen6), une origine de réplication  levure (ARSH4) et un marqueur d’auxotrophie (Histidine) et un élément permettant sa sélection chez les mycoplasmes (le marqueur de résistance à la tétracycline, tetM). Après transformation, les génomes marqués sont isolés des mycoplasmes par des méthodes d’extractions douces, puis transférés dans des sphéroplastes de levures par des méthodes de transformation standards. Une fois clonés dans la levure, les génomes de mycoplasmes, maintenus de façon stable, peuvent être modifiés  grâce aux outils génétiques disponibles chez cet organisme, notamment le système CRISPR/Cas9. Les génomes modifiés sont ensuite extraits de la levure et transplantés dans une cellule receveuse adéquate de façon à obtenir des  mycoplasmes mutants qui seront ensuite caractérisés au niveau génotypique et phénotypique. Dans certains cas, les génomes de mycoplasmes doivent être méthylés in vitro, avant l’étape de transplantation pour ne pas être clivés par les systèmes de restriction présents dans la cellule receveuse.
Ce cycle peut être répété autant que nécessaire (flèche hachurée) afin de produire des modifications multiples dans les génomes de mycoplasmes clonés dans la levure (délétions, additions, remplacements de gènes)  et le panel des mutants correspondants. Figure adaptée de Lartigue et al, 2009